Opdagelsen af en international gruppe forskere, der inkluderer to brasilianere, kan bidrage til at minimere forurening forårsaget af materialet
En international gruppe forskere, hvor to brasilianere fra University of Campinas (Unicamp) deltager, formåede at forbedre ydelsen for PETase, et enzym, der er i stand til at fodre på polyethylenterephthalat, PET-plast. Efter at PETase blev opdaget i en ny bakterieart i 2016, arbejdede forskergruppen for at få strukturen af enzymet og forstå dets funktion. I denne proces endte de ved et uheld med at skabe en mutation af enzymet, der har en endnu større affinitet med PET - det vil sige et større potentiale for at nedbryde plast.
Arbejdet har et enormt potentiale for praktisk anvendelse, da det anslås, at der sendes mellem 4,8 og 12,7 millioner tons plast hvert år i havene - et tal, der kun har tendens til at vokse. Plast, der akkumuleres selv på de fjerneste strande på planeten, bruges så netop på grund af deres modstand mod nedbrydning, hvilket er det, der mest truer miljøet. Når den kasseres, kan en PET-flaske for eksempel forblive i miljøet i 800 år - ud over det voksende og alarmerende problem med mikroplast.
- Forstå miljøpåvirkningen af plastaffald i fødekæden
- Hvad er oprindelsen af plasten, der forurener havene?
Med alt dette er det let at forstå den store interesse, der vækkes ved opdagelsen af et enzym, der er i stand til at fordøje polyethylenterephthalat. Dette enzym, kaldet PETase, har nu øget dets evne til at nedbryde plast. Nyheden blev beskrevet i en artikel offentliggjort i Proceedings of the National Academy of Sciences i De Forenede Stater (PNAS).
To forskere fra Chemistry Institute ved State University of Campinas (IQ-Unicamp) deltog i forskningen i samarbejde med forskere fra Det Forenede Kongerige (University of Portsmouth) og USA (National Renewable Energy Laboratory). De er postdoktor Rodrigo Leandro Silveira og hans vejleder, den fulde professor og dekan for forskning ved Unicamp Munir Salomão Skaf.
”Polyethylenterephthalat, der hovedsagelig anvendes til fremstilling af drikkevareflasker, er også meget brugt til fremstilling af tøj, tæpper og andre genstande. I vores forskning karakteriserede vi den tredimensionelle struktur af enzymet, der er i stand til at fordøje denne plastik, konstruerer den, øger dens nedbrydningskraft og demonstrerer, at den også er aktiv i polyethylen-2,5-furandicarboxylat (PEF), en erstatning for PET fremstillet af fra vedvarende råvarer, ”sagde Silveira til Agência FAPESP.
Interessen for PETase opstod i 2016, da en gruppe japanske forskere, ledet af Shosuke Yoshida, identificerede en ny bakterieart, Ideonella sakaiensis , i stand til at bruge polyethylenterephthalat som kulstof- og energikilde - med andre ord kapabel at fodre med PET. Det er indtil i dag den eneste kendte organisme med denne kapacitet. Det vokser bogstaveligt talt på PET.
”Ud over at identificere Ideonella sakaiensis opdagede japanerne, at de producerede to enzymer, der udskilles i miljøet. Et af de secernerede enzymer var PETase. På grund af sin grad af krystallinitet er PET en polymer, der er meget vanskelig at nedbrydes. Vi bruger teknisk udtrykket 'recalcitrance' til at navngive den egenskab, som visse højpakkete polymerer skal modstå nedbrydning. PET er en af dem. Men PETase angriber og nedbryder det i små enheder - mono (2-hydroxyethyl) terephthalsyre (MHET). MHET-enhederne omdannes derefter til terephthalsyre [af et andet enzym] og absorberes og metaboliseres af bakterierne, ”sagde Silveira.
Alle kendte levende ting bruger biomolekyler til at overleve. Alle undtagen Ideonella sakaiensis, som formår at bruge et syntetisk molekyle, fremstillet af mennesker. Dette betyder, at denne bakterie er resultatet af en meget ny evolutionær proces, der fandt sted i løbet af de sidste par årtier. Det lykkedes at tilpasse sig en polymer, der blev udviklet i begyndelsen af 1940'erne og først begyndte at blive brugt i industriel skala i 1970'erne. Til dette er PETase den vigtigste del.
”PETase gør den sværeste del, nemlig at bryde den krystallinske struktur og depolymerisere PET i MHET. Arbejdet med det andet enzym, der omdanner MHET til terephthalsyre, er allerede meget enklere, da dets substrat er dannet af monomerer, hvortil enzymet har let adgang, fordi de er dispergeret i reaktionsmediet. Derfor fokuserede undersøgelserne på PETase ”, forklarede Silveira.
Det næste trin var at studere PETase i detaljer, og det var bidraget fra den nye forskning. ”Vores fokus var at finde ud af, hvad der gav PETase muligheden for at gøre noget, som andre enzymer ikke var i stand til at gøre meget effektivt. Til dette var det første skridt at opnå dette tredimensionelle struktur af dette protein, ”sagde han.
”At opnå den tredimensionelle struktur betyder at opdage x-, y- og z-koordinaterne for hvert af de tusinder af atomer, der udgør makromolekylet. Vores britiske kolleger udførte dette arbejde ved hjælp af en velkendt og anvendt teknik, kaldet røntgendiffraktion ”, forklarede han.
Modificeret enzym binder bedre til polymeren
Efter at have opnået den tredimensionelle struktur begyndte forskerne at sammenligne PETase med relaterede proteiner. Den mest lignende er en cutinase af bakterien Thermobifida fusca, som nedbryder cutin, en slags naturlig lak, der dækker planternes blade. Visse patogene mikroorganismer bruger cutinaser til at bryde cutinbarrieren og passe de næringsstoffer, der findes i bladene.
Billede: PETase-struktur, i blåt, med en PET-kæde (i gul) forbundet til sit aktive sted, hvor den nedbrydes. Pressemeddelelse / Rodrigo Leandro Silveira.
”Vi fandt ud af, at i det område af enzymet, hvor kemiske reaktioner forekommer, det såkaldte 'aktive sted', viste PETase nogle forskelle i forhold til cutinase. Det har et mere åbent aktivt sted. Gennem computersimuleringer - og det var den del, hvor jeg bidrog mest - var vi i stand til at studere enzymets molekylære bevægelser. Mens den krystallografiske struktur, opnået ved røntgendiffraktion, giver statisk information, gør simuleringerne det muligt at have dynamisk information og at opdage den specifikke rolle, som hver aminosyre spiller i nedbrydningsprocessen for PET ”, forklarede forskeren fra IQ-Unicamp.
Molekylets bevægelsers fysik skyldes de elektrostatiske attraktioner og frastødninger af det enorme sæt atomer og temperaturen. Computersimuleringer tillod os bedre at forstå, hvordan PETase binder og interagerer med PET.
”Vi fandt ud af, at PETase og cutinase har to forskellige aminosyrer på det aktive sted. Gennem molekylærbiologiske procedurer producerede vi derefter mutationer i PETase med det formål at omdanne det til cutinase ”, sagde Silveira.
”Hvis vi var i stand til at gøre det, ville vi vise, hvorfor PETase er PETase, det vil sige, vi ville vide, hvilke komponenter der giver det den ejendommelige egenskab ved nedværdigende PET. Men til vores overraskelse, når vi prøver at undertrykke PETase's ejendommelige aktivitet, det vil sige når vi prøver at omdanne PETase til cutinase, producerer vi en endnu mere aktiv PETase. Vi søgte at reducere aktiviteten, og i stedet øgede vi den ”, sagde han.
Dette krævede yderligere beregningsstudier for at forstå, hvorfor den mutante PETase var bedre end den oprindelige PETase. Med modellering og simuleringer var det muligt at bemærke, at ændringer produceret i PETase favoriserer koblingen af enzymet med substratet.
Det modificerede enzym binder bedre til polymeren. Denne kobling afhænger af geometriske faktorer, det vil sige typen "nøgle og lås" mellem de to molekyler. Men også af termodynamiske faktorer, det vil sige af interaktionerne mellem de forskellige komponenter i enzymet og polymeren. Den elegante måde at beskrive dette på er at sige, at den modificerede PETase har "større affinitet" for substratet.
Med hensyn til en fremtidig praktisk anvendelse, at opnå en ingrediens, der er i stand til at nedbryde tonsvis af plastaffald, var undersøgelsen en kæmpe succes. Men spørgsmålet om, hvad der gør PETase til en PETase, forbliver ubesvaret.
”Cutinase har aminosyrer a og b. PETase har aminosyrerne x og y. Vi forestiller os, at ved at udveksle x og y for a og b, ville vi være i stand til at omdanne PETase til en cutinase. I stedet producerer vi en forbedret PETase. Med andre ord er de to aminosyrer ikke forklaringen på de to enzymers differentierede adfærd. Det er noget andet, ”sagde Silveira.
Løbende udvikling
Cutinase er et gammelt enzym, mens PETase er et moderne enzym, der skyldes det evolutionære tryk, der gjorde det muligt for Ideonella sakaiensis at tilpasse sig et medium, der kun eller hovedsageligt indeholder polyethylenterephthalat som kilde til kulstof og energi.
Blandt de mange bakterier, der ikke er i stand til at bruge denne polymer, har en eller anden mutation genereret en art, der har formået at gøre det. Denne bakterie begyndte at reproducere og vokse meget mere end de andre, fordi den havde nok mad. Med det udviklede det sig. I det mindste er dette forklaringen fra standard evolutionsteori.
”Det faktum, at vi fik et bedre enzym ved at foretage en lille ændring, antyder stærkt, at denne udvikling endnu ikke er afsluttet. Der er stadig nye evolutionære muligheder, der skal forstås og udforskes for at opnå endnu mere effektive enzymer. Forbedret PETase er ikke slutningen af vejen. Det er kun begyndelsen, ”sagde Silveira.
Med henblik på anvendelse er det næste trin at flytte fra laboratorium til industriel skala. Til dette er yderligere undersøgelser relateret til reaktorteknik, procesoptimering og omkostningsreduktion nødvendige.
